南京英瀚斯(圖)-*編輯技術(shù)-榆林細胞

關(guān)于細胞凍存的注意事項：
1. 為保持細胞大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。
2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為－1℃~12℃/ 分鐘，當溫度下降達－25℃時，下降速度可增至－5~－10℃/ 分鐘，到－100℃時則可迅速凍入液氮中。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度，過快能影響細胞內(nèi)水分透出，太慢則促冰晶形成。
3. 初次凍存者在下降凍存時，宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置，然后需用溫度計與凍存物并行的辦法，以觀測下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系，當已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后，僅按下降時間和下降距離便可獲理想凍存效果。
細胞實驗介紹——流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡
流式細胞術(shù)檢測細胞周期：
細胞周期：指細胞從*次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由g0/g1期、s期、g2期和m期組成。g0/g1期：有絲分裂發(fā)生，細胞分裂成兩個細胞，進入下一個細胞周期，或者進入靜止期（g0期），而g0期從dna含量上無法與g1期區(qū)分，細胞開始rna和蛋白質(zhì)的合成，但dna含量仍保持二倍體。s期：dna開始合成，細胞培養(yǎng)，細胞核內(nèi)dna的含量介于g1期和g2期之間。g2期和m期：當dna成為4倍體時，細胞進入g2期。g2期細胞繼續(xù)合成rna及蛋白質(zhì)，直到進入m期。
pi法是經(jīng)典的周期檢測方法。pi為插入性核酸熒光染料，榆林細胞，能選擇性的嵌入核酸dna和rna雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與dna的含量成正比例關(guān)系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的dna分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。
一般流程：細胞收集-70%酒精固定過夜-pi染色-流式細胞儀檢測。
細胞凋亡：細胞凋亡的早期就有細胞膜表面*損發(fā)生。*損時凋亡細胞表面的磷脂腺絲氨酸(ps)可以從細胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細胞的外膜。該過程發(fā)生在之前，檢測ps的表達，能反映早期凋亡。annexinv是ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對ps有很高的親和性，并且可以與暴露于細胞外的ps相結(jié)合。利用這一原理，可以將annexinv標記熒光來識別早期的細胞凋亡。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)來區(qū)分凋亡和壞死細胞。pi的膜通透性很差，因而只能標記壞死的細胞。
一般流程：細胞收集-pi-annexinv標記-流式細胞儀檢測。
結(jié)果示例：
圖 a 細胞周期檢測圖；b 細胞凋亡檢測圖
二、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟1、操作步驟 [方法一]：
(1) 細胞培養(yǎng)：取 6 孔培養(yǎng)板 (或用 35 mm 培養(yǎng)皿)，向每孔中加入 2 ml 含 1～2×105 個細胞培養(yǎng)液，37℃ co2 培養(yǎng)至 40%～60% 匯合時 (匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞)。
(2) 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液 (為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量)a 液：用不含培養(yǎng)基稀釋 1-10 μg dna，終量 100μl，b 液：用不含培養(yǎng)基稀釋 2-50 μglr，*編輯技術(shù)，終量 100μl，輕輕混合 a、b 液，室溫中置 10-15 分鐘，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染 (如出現(xiàn)沉淀可能因 lr 或 dna 濃度過高所致，應(yīng)酌情減量)。
(3) 轉(zhuǎn)染準備：用 2 ml 不含培養(yǎng)液*洗兩次，293t細胞，再加入 1 ml 不含培養(yǎng)液。
(4) 轉(zhuǎn)染：把 a/b 復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃ 溫箱置 6～24 小時，吸除無轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
(5) 其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。
注意：轉(zhuǎn)染時切勿加，對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。
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