英瀚斯(圖)-細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)-湖南細(xì)胞

mtt檢測(cè)
mtt 是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測(cè)原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 mtt 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（formazan）并沉積在細(xì)胞中，湖南細(xì)胞，而死細(xì)胞無此功能。二jia基亞砜（dmso）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)報(bào)告，用酶聯(lián)免yi檢測(cè)儀在 570nm 波長處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活xi胞數(shù)量。
軟瓊脂培養(yǎng)克l隆形成試驗(yàn)基本步驟:
(1)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，使之成為單細(xì)胞，作活l細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血l清的dmem培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1x106細(xì)胞/l。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會(huì)凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xdmem培養(yǎng)基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10ml)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置co2溫箱中備用。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xdmem培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2ml的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37回5%co2溫箱中培養(yǎng)10~14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞數(shù)。計(jì)算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫l瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過40日。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗(yàn)。
軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)(軟瓊脂克l隆)
將1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，6孔板中每個(gè)孔1.4ml溫室凝固，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000個(gè)/ml，將0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細(xì)胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，室溫凝固。置于37目，5%co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上得克l隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率，spotll 采集圖像。
透射電鏡觀察自噬小體方法
利用光學(xué)顯微鏡，借助相應(yīng)的染色方法，可以觀察細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)出現(xiàn)的一系列形態(tài)特征。常用的染色法包括臺(tái)盼藍(lán)、橙 / 化乙啶（ao/eb）、giemsa 和 he 法等。在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到核固縮、質(zhì)濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現(xiàn)象。
電鏡形態(tài)學(xué)觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。電鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體出現(xiàn)等。
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